撰寫者|隨著基因工程的發(fā)展，現(xiàn)代生物技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞馴化為生物工廠。常用的表達(dá)平臺包括用于制造相對較小且簡單的治療性蛋白質(zhì)的大腸桿菌，以及用于制造更復(fù)雜分子的酵母和哺乳動物細(xì)胞。決定是否使用新的表達(dá)平臺取決于是否有方法對生物體進(jìn)行基因改造以實(shí)現(xiàn)外源蛋白的穩(wěn)定高效表達(dá)。它還取決于該生物體是否適合大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化。生物學(xué)特性。轉(zhuǎn)基因植物具有與培養(yǎng)細(xì)胞不同的質(zhì)量特征，例如光合作用生長和易于擴(kuò)大規(guī)模。然而，由于遺傳方法繁瑣、生長速度慢、產(chǎn)量低和監(jiān)管限制，轉(zhuǎn)基因植物的潛力尚未發(fā)揮出來。在生物技術(shù)應(yīng)用中，藻類被視為植物的替代品，但藻類難以進(jìn)行基因改造，而且外源蛋白的表達(dá)水平較低且往往不穩(wěn)定。迄今為止，還沒有利用藻類平臺的商業(yè)化生物治療藥物。光合螺旋藻是世界上唯一一種商業(yè)化種植的食品微生物，其蛋白質(zhì)含量超過所有其他糧食作物，使其成為高水平表達(dá)治療性蛋白質(zhì)的有力候選者。螺旋藻的營養(yǎng)繁殖降低了基因逃逸到食物鏈的風(fēng)險，以及相關(guān)的食品安全和監(jiān)管問題。因此，螺旋藻有望展示植物在生物制藥中的優(yōu)勢，有可能克服其他基于作物或藻類的平臺的挑戰(zhàn)和局限性。 2022年3月21日，美國Lumen生物技術(shù)公司的James Roberts等人在《Nature Biotechnology》上發(fā)表了題為“Development of spirulina for the Manufacturing andoral Delivery of Protein Therapy”的研究論文。他們提出了螺旋藻的基因工程方法，包括利用無標(biāo)記同源重組將外源基因整合到螺旋藻染色體中，穩(wěn)定高水平表達(dá)治療蛋白，包括生物活性肽、單鏈抗體和酶。信號蛋白和疫苗抗原。作者介紹了在動態(tài)良好生產(chǎn)規(guī)范（cGMP）下利用螺旋藻進(jìn)行大規(guī)模藥品生產(chǎn)的室內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，并進(jìn)一步報道了針對空腸彎曲菌引起的胃腸道感染的可食用抗體藥物的開發(fā)，以證明螺旋藻的應(yīng)用該平臺可滿足緊迫的醫(yī)療需求，包括彎曲桿菌病動物模型的驗證以及第一階段人體臨床試驗的安全性和藥代動力學(xué)演示。

作者的研究發(fā)現(xiàn)，盡管螺旋藻被認(rèn)為難以進(jìn)行基因改造，但它實(shí)際上具有天生的轉(zhuǎn)化能力。他們將螺旋藻（UTEX LB1926 和NIES-39）在帶有融合載體的液體培養(yǎng)基中孵育，該融合載體包括選擇性標(biāo)記和側(cè)翼與螺旋藻染色體同源的序列的感興趣基因。轉(zhuǎn)化的DNA 通過同源重組過程進(jìn)行靶向整合，用插入位點(diǎn)側(cè)翼的引物對染色體DNA 進(jìn)行測序表明，這種轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生了大約100 個獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。在連續(xù)選擇的條件下，多倍體螺旋藻在轉(zhuǎn)化后8-10周發(fā)生純合分離，此后轉(zhuǎn)基因得到穩(wěn)定的遺傳表達(dá)。連續(xù)繁殖1年以上的9株菌株均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因序列發(fā)生變化，甚至有2株連續(xù)繁殖3年以上（800代細(xì)胞）也未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因序列發(fā)生任何變化。值得注意的是，螺旋藻只有在與微生物共培養(yǎng)時才表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化能力。因此，作者使用外源菌株進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，使用非菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)。通過用外源鏈霉素抗性基因（aadA）替換螺旋藻KmR基因的一段，然后用串聯(lián)的KmR基因和目的基因替換addA，可以開發(fā)一種無標(biāo)記基因工程方法來修飾螺旋藻。改造菌株的目的基因整合在KmR基因的一側(cè)，沒有其他外源基因。作者使用多種外源DNA載體導(dǎo)入螺旋藻基因組，包括單基因、串聯(lián)基因、操縱子等。最大的轉(zhuǎn)化DNA盒達(dá)到6.0 kb，包含7個基因的c-藻藍(lán)蛋白操縱子。多種不同的外源蛋白，包括生物活性肽、抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域等，可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。其中，使用來自c-藻藍(lán)蛋白基因座（Pcpc600）的強(qiáng)啟動子表達(dá)的蛋白質(zhì)占總可溶性蛋白質(zhì)的累積比例。 29%。作者利用修飾螺旋藻（SP526）表達(dá)可用于預(yù)防彎曲桿菌病的抗體藥物，并在小鼠模型中驗證了口服藥物的預(yù)防效果。他們發(fā)現(xiàn)SP526 治療可以將糞便中的彎曲桿菌減少到3 至3 4 個數(shù)量級，并顯著減少腸道炎癥的兩種生物標(biāo)志物，脂蛋白2 (LCN-2) 和髓過氧化物酶(MPO)。對照組所有小鼠均出現(xiàn)腹瀉，但口服SP526的小鼠未出現(xiàn)腹瀉。劑量范圍實(shí)驗表明，口服2 mg 干SP526 可預(yù)防彎曲菌病。這在攻擊后24 小時加速了彎曲桿菌從腸道的排泄，并在72 小時后減少了彎曲桿菌的排泄。為了試驗大規(guī)模可持續(xù)生產(chǎn)，作者開發(fā)了模塊化、室內(nèi)、160-2000 升垂直平板光生物反應(yīng)器，其中pH 值和空氣混合可以控制。商業(yè)規(guī)模的制造可以通過增加反應(yīng)器的數(shù)量而不是其體積來實(shí)現(xiàn)。生長后，用海藻糖溶液沖洗螺旋藻漿液并噴霧干燥。通過優(yōu)化干燥效率、濕度和抗體活性保留等參數(shù)設(shè)計，抗體活性保留率達(dá)到90%以上。收集干粉，密封于避光防潮的包裝中，42下抗體活性保持至少6個月。最后將粉末封裝在素食膠囊中。產(chǎn)品生產(chǎn)過程嚴(yán)格遵循cGMP。作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)螺旋藻用于遞送抗體藥物時，在模擬胃環(huán)境中孵育兩個小時后，超過70%的藥物保持完整，這表明螺旋藻涂層可以為藥物提供保護(hù)。在模擬十二指腸的較高pH環(huán)境下，螺旋藻可在60分鐘內(nèi)釋放90%以上的藥物。此外，首次人體臨床安全性試驗也取得了良好的結(jié)果。這項研究發(fā)現(xiàn)螺旋藻可用于配制和高效表達(dá)蛋白質(zhì)藥物。其產(chǎn)能和功效是其他食品平臺的十倍甚至百倍，為口服蛋白藥物的生產(chǎn)提供了新的有力工具。

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https://doi.org/10.1038/s41587-022-01249-7 制版者：11

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