在上一期重新編碼遺傳密碼的過程中（一）提到Peter Schultz團(tuán)隊(duì)通過引入生物正交的tRNA/氨酰-tRNA合成酶，首次實(shí)現(xiàn)了非天然氨基酸在體內(nèi)的定點(diǎn)整合與大腸桿菌配對(duì)。目前，舒爾茨等科學(xué)家可以通過這種方法將200多種非天然氨基酸整合到蛋白質(zhì)中，這為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能提供了極大的便利，例如在蛋白質(zhì)中引入熒光標(biāo)記或其他標(biāo)簽，或者實(shí)施光籠化。 （Photocaging）實(shí)驗(yàn)，通過用光敏基團(tuán)覆蓋實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)使其失活。該蛋白在特定光激發(fā)后恢復(fù)其功能，可用于研究生物過程和生物系統(tǒng)的時(shí)空調(diào)控。

當(dāng)有機(jī)體突破自然限制，擁有20多種氨基酸時(shí)，會(huì)是什么樣子？早期研究表明，在44以上的最簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中，大腸桿菌的生長(zhǎng)速度會(huì)顯著下降，添加蛋氨酸可以部分緩解這種情況。高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(MetA) 是一種主要參與蛋氨酸合成的酶，在40C 以上不穩(wěn)定。 Schultz團(tuán)隊(duì)將MetA催化中心外的大部分位點(diǎn)（261/308）突變?yōu)殓杲K止密碼子TAG，形成文庫，并將該文庫與含有琥珀抑制子tRNA/aaRS的多特異性琥珀無義抑制子tRNA/氨?；鶎?duì)進(jìn)行比較。 -tRNA 合成酶(aaRS) 對(duì)) 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JW39731 (metA) 突變株中。請(qǐng)注意，琥珀抑制子tRNA/aaRS 對(duì)與宿主tRNA/aaRS 對(duì)正交。將轉(zhuǎn)化菌株置于液體基本培養(yǎng)基中。 44C 培養(yǎng)20 至40 小時(shí)后，將細(xì)胞鋪板，選擇單克隆并測(cè)序。最后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)21TAG被非天然氨基酸（對(duì)苯甲酰苯基）丙氨酸（pBzF）取代后的MetA突變體的Tm值增加了21（Tm，熔解溫度表示蛋白質(zhì)穩(wěn)定性）。將F21TAG metA突變體和相應(yīng)的tRNA/aaRS對(duì)（pEVOL-pBzF）共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌metA突變株中，并在含有1mM pBzF的培養(yǎng)基中與野生型大腸桿菌平行培養(yǎng)?？梢钥吹酵蛔冎瓯纫吧晟L(zhǎng)得更快。

通過引入非天然氨基酸來改變蛋白質(zhì)性能的案例有很多。除了上述通過引入非天然氨基酸來提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性外，還有對(duì)環(huán)肽、抗體、酶和噬菌體進(jìn)行修飾以提高親和力。催化活性和適應(yīng)性等

高熱穩(wěn)定性MetA的篩選

除了對(duì)大腸桿菌中的遺傳密碼進(jìn)行重新編程之外，科學(xué)家們還在線蟲、果蠅、植物甚至小鼠中進(jìn)行了測(cè)試。 Chin、劍橋大學(xué)的神經(jīng)科學(xué)家Michael Hastings 及其同事利用擴(kuò)展的遺傳密碼在小鼠體內(nèi)創(chuàng)建了翻譯調(diào)節(jié)開關(guān)。脊髓上核（SCN）是哺乳動(dòng)物的主要生物鐘，協(xié)調(diào)生理和行為的日常節(jié)律。晝夜節(jié)律圍繞自我維持的轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋環(huán)路(TTFL) 展開，其中CLOCK 和BMAL1 驅(qū)動(dòng)負(fù)調(diào)節(jié)因子period 和Cryptochrome (Cry) 的表達(dá)。 Cry1 和Cry2 的整體刪除使TTFL 無效，導(dǎo)致下游行為心律失常。作者將攜帶琥珀終止密碼子的Cry1蛋白構(gòu)建到由Cry啟動(dòng)子控制的腺相關(guān)病毒（AAV）載體中，該載體可以整合炔基賴氨酸N6-[(2-丙炔氧基)羰基]-L-賴氨酸正交氨酰基-tRNA氨基酸合成酶/tRNACUA (AlkK)被構(gòu)建到另一個(gè)AAV載體中，其中氨?；?tRNA合成酶由神經(jīng)元特異性突觸蛋白依賴性啟動(dòng)子控制。通過腦內(nèi)注射將兩種AAV 遞送至Cry 缺陷小鼠的SCN，將其用作打開和關(guān)閉小鼠腦細(xì)胞中基因的開關(guān)。由于小鼠無法自行合成AlkK，因此研究人員可以通過在嚙齒類動(dòng)物的飲用水中添加或去除AlkK 來控制其晝夜節(jié)律。

Cry1 表達(dá)的翻譯調(diào)節(jié)開關(guān)調(diào)節(jié)小鼠晝夜節(jié)律

擴(kuò)展遺傳密碼在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也正在積極開展。蛋白質(zhì)與其他分子之間的相互作用通常是相對(duì)較弱的非共價(jià)結(jié)合。轉(zhuǎn)換為共價(jià)結(jié)合可能會(huì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)的有效性。因此，加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的化學(xué)生物學(xué)家王磊正在開展如何與生物分子相互作用的研究。共價(jià)連接的蛋白質(zhì)藥物。 2020年，王雷團(tuán)隊(duì)開發(fā)了PERx（proximity-enabled reactivity）處理技術(shù)。蛋白質(zhì)藥物中隱藏的生物活性非天然氨基酸穩(wěn)定存在于蛋白質(zhì)和細(xì)胞中。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)藥物與目標(biāo)蛋白質(zhì)中的某些天然物質(zhì)相互作用時(shí)，當(dāng)氨基酸殘基足夠接近時(shí)，就會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。作者早期發(fā)現(xiàn)非天然氨基酸氟磺酸鹽-L-酪氨酸(FSY) 可以與附近的組氨酸、酪氨酸或賴氨酸發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)氟化硫交換反應(yīng)(SuFEx)。作者將FSY 引入免疫檢查點(diǎn)蛋白PD-1 中，從而創(chuàng)造出一種抗腫瘤藥物。通常，T 細(xì)胞上的PD-1 和腫瘤細(xì)胞上的PD-L1 之間的相互作用會(huì)抑制免疫反應(yīng)，使腫瘤逃避免疫監(jiān)視。當(dāng)作者將含有FSY 的PD-1 注射到植入人類癌細(xì)胞的小鼠體內(nèi)時(shí)，該蛋白質(zhì)與PD-L1 形成不可逆的共價(jià)鍵，阻斷了T 細(xì)胞表面PD-L1 與PD-1 的相互作用。導(dǎo)致腫瘤縮小，效果與阻斷PD-L1抗體相當(dāng)或更好。 Enlaza Therapeutics獲得了UCSF對(duì)該共價(jià)治療技術(shù)的獨(dú)家授權(quán)，并于2022年12月15日完成6100萬美元種子融資后正式上線。王雷擔(dān)任該公司的科學(xué)顧問。官網(wǎng)并未透露管道信息。

通過PERx技術(shù)開發(fā)共價(jià)蛋白藥物

參考來源：

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